一、 艾滋病概述

艾滋病(AcquiredImmunodeficiency Syndrome, AIDS)，是由人免疫缺陷病毒（HumanImmunodeficiency Virus, HIV）引起，以全身免疫系统严重损害为特征的传染性疾病，是20世纪危害人类健康和生命最严重的病毒性疾病之一。自美国CDC报道首例艾滋病后，到20世纪80年代中期艾滋病发展成为一个性的流行病。截止2014年底，HIV已感染3690万人，2014年新增感染者200万，2014年因艾滋病死亡120万人。艾滋病在1985年传入我国，截至2015年5月31日，历年累计报告艾滋病530628例，其中艾滋病病人217457例，死亡167159例。艾滋病早已成为关注的公共卫生和社会热点问题，艾滋病的预防与治疗也成为当代生物医学研究的前沿热点之一。

二、艾滋病动物模型简介

艾滋病发病机制研究、药物和疫苗的保护性研究及评价等方面在很大程度上依赖理想的动物模型。SIV/SAIDS(猴艾滋病)模型被广泛接受和应用，表现为和AIDS的临床表征，发病过程、免疫缺陷特征等非常相似。然而，由于HIV与SIV毕竟是两种不同的病毒，它们在基因序列、包膜结构和抗原性之间存在一定差异，使该模型的使用有一定的局限性。近年来，人们应用分子生物学技术，将HIV-1重要基因与SIV做成嵌合体病毒（SIV/HIV-1，简称为SHIV）感染恒河猴，用以研究HIV不同基因的功能以及病毒与宿主的相互作用。

R.M. Ruprecht以SHIV-KB9为骨架构建了表达HIV-1 C亚型env的SHIV-1157i，并经静脉途径感染印度恒河猴得到SHIV-1157ipd3N4。它所具有高度复制能力的、CCR5受体嗜性、经粘膜传播这些特性，使它在研究HIV感染和发病机制及评价AIDS候选疫苗的功效方面具有重要的现实意义。

艾滋病的三种传播途径分别是经血液、性和母婴传播，性传播包括同性传播和异性传播两种方式。艾滋病动物模型的制备首先要考虑其实际应用价值，最好的动物模型可以最大限度的模拟人类疾病，包括使用与自然感染相同或接近的方式建立模型。为模拟同性间性传播的感染方式，通过直肠粘膜上皮途径感染，病毒直接感染M细胞、上皮细胞等。直肠的生理构造及上皮细胞厚度非常薄等特点，都使直肠感染较阴道感染容易发生。将病毒缓慢注入猴直肠内，可建立同性性传播动物模型。

1、 实验用病毒：感染毒株SHIV-1157ipd3N4，病毒原液滴度为1×106 TCID50/mL（TZM-bl细胞滴定）。

2、感染动物：选用体重4-6kg的SPF恒河猴。实验前体检无异常，必须排除猴免疫缺陷病毒(SIV)、猴逆转录D型病毒(SRV-1，2，5)和猴T淋巴细胞性I型病毒(STLV-1)的感染。猴免疫缺陷病毒（SIV）易感性密切相关的4种基因（Mamu-A*01、Mamu-A*02、Mamu-B*08、Mamu-B*17）筛查结果为阴性。所有感染动物必须在ABSL-3室中进行。

3、 感染方法：将麻醉好的实验猴放在操作台上，动物采取俯卧位以保证直肠粘膜充分暴露，缓慢将SHIV-1157ipd3N4中国恒河猴细胞适应株的稀释液注入肛窦处，实验猴保持此姿势30min。

4、 SHIV-1157ipd3N4直肠感染猴样品采集和指标测定：感染采取小量多次的方法，共接种13次，前3次接种的病毒浓度为10TCID50/mL，然后20TCID50/mL接种5次，再50TCID50/mL接种4次，最后对仍未感染的G1023R100 TCID50/mL接种1次，每次接种间隔4-7d。在每次感染前及13次感染结束后定期采EDTA抗凝血3ml，分别测定CD348及血浆病毒载量。

5、 SHIV-1157ipd3N4直肠感染猴血浆病毒载量的测定：提取EDTA抗凝血浆中病毒RNA,使用SYBRGreen I 实时荧光定量RT-PCR方法测定血浆病毒载量。

6、 SHIV-1157ipd3N4直肠感染猴外周血CD4+/CD8+比值及绝对数测定：CD3-PerCP、CD4-FITC、CD8-PE抗体标记EDTA抗凝全血淋巴细胞，流式细胞仪测定CD4+/CD8+比值，并根据血常规结果，计算出CD4+T细胞绝对数。

SHIV-1157ipd3N4直肠感染恒河猴外周血病毒载量结果

小剂量多次感染使直肠组10只猴感染SHIV-1157ipd3N4后检出血浆病毒RNA载量和载量峰值的时间点各不相同，G1015R、G1016R、G1019R和G1022R早在感染后14d检出，G1018R出现在18d，G1017R出现在21d，G1020R、G1021R和G1024R出现在35d，G1023R最后出现在56d。所有实验猴的血浆病毒RNA载量峰值都在阳转后1w内出现，G1015R和G1016R在21d峰值过后，35d时出现约105 copies/ml的反弹；G1017R和G1023R都只出现了2个大小相近的小高峰，21d时G1017R峰值约105 copies/ml而56d时G1023R峰值约104 copies/ml；G1019R、G1020R和G1022R存在105-106 copies/ml水平的大小相近的数据点，峰值不明显；G1018R、G1021R和G1024R分别在21d、35d和35d出现105 copies/ml以上的明显峰值。10只感染猴载量峰值的范围是2.89×104-2.38×106 copies/ml。在全部13次小剂量感染结束后，10只感染猴都进入103-104 copies/ml平台期（图1）。

图1 SHIV-1157ipd3N4小剂量多次直肠途径感染中国恒河猴血浆病毒载量结果

Fig.1The viremia (viral RNA copies/ml plasma) in Chinese-original rhesus macaquesinfected intrarectally with repeated low dose of SHIV-1157ipd3N4

1、 SHIV-1157ipd3N4直肠感染恒河猴外周血CD4+/CD8+比值结果

10只感染猴外周血CD4+/CD8+T淋巴细胞比值在小剂量多次感染过程中呈现多次小幅度波动，总体保持稳定，其中G1016R、G1018R、G1020R、G1021R、G1023R和G1024R出现明显一过性下降，随后迅速恢复。随感染时间延长，G1016R、G1019R和G1021R外周血CD4+/CD8+T淋巴细胞比值逐渐下降至0.43-1.0并维持倒置，而G1015R始终徘徊在1.0，其它感染猴稳定在1.0以上（图2）。

图2SHIV-1157ipd3N4小剂量多次直肠途径感染中国恒河猴外周血CD4+/CD8+比值

Fig.2 The changes of CD4+/CD8+ ratio of T lymphocytes in Chinese-original rhesus macaques infected intrarectallywith repeated low dose of SHIV-1157ipd3N4

1、 SHIV-1157ipd3N4直肠感染恒河猴外周血CD4+T细胞绝对数结果

10只感染猴外周血CD4+T淋巴细胞绝对数在小剂量多次感染过程中基本保持稳定，存在小幅度的波动。56d后明显升高并维持在这一相对高水平，其中G1018R、G1020R和G1022R在63d时升高约1000/μL，幅度较大，其余感染猴升高约500/μL（图3）。

图3SHIV-1157ipd3N4小剂量多次直肠途径感染恒河猴外周血CD4+T细胞绝对数变化

Fig.3 TheCD4+ T cell counts (per l blood) in Chinese-original rhesus macaquesinfecte intrarectally with repeated low dose of SHIV-1157ipd3N4

1.该模型制备比较成熟，国内外都有此模型，构建和评价指标一致，所以该模型应用广泛，具有统一的操作规程。

2. 该模型制备的关键：1）小鼠必须是重度免疫缺陷的，而且饲养环境必须洁净；2）HIV操作需要生物安全。

3.此模型具有完善的人的免疫系统，HIV感染后，具有艾滋病病人相似的临床症状，所以具有很高的比较医学应用价值。