帕金森病（Parkinson's disease，PD）是最常见的慢性神经系统退行性病变之一, 其主要症状是运动功能的改变，如运动过缓、静止震颤、步态畸形和姿势不稳等病变，最后导致运动能力丧失。流行病学调查显示，随着年龄增长PD患病率逐渐增高，55岁以上的人群中，帕金森病的患病率超过1%，65岁以上约为2%，是威胁老年社会人类健康的重大疾病。

帕金森病以黑质和纹状体多巴胺能神经元进行性缺失、α –synuclein聚集和Lewy小体的形成为主要特点。α–synuclein基因的两种错义突变(A53T、A30P)与家族性帕金森病密切相关，α–synA53T突变可能会促进蛋白的自我聚集，形成路易小体，诱发帕金森病。为了阐明α-synuclein在PD中的可能作用机制，人们利用不同的外源启动子如PDGF-β、PrP 、Teto和Thy1等驱动构建了多种α-synucleinA53T突变基因（α -synA53T）转基因小鼠模型。尽管不同的启动子在脑组织的表达谱有差别，这些小鼠模型均能引起人类帕金森病的部分关键表型和病理特征。

目前α –synuclein的功能仍不清楚，但大量研究发现其存在于许多神经系统变性疾病的突触末梢或细胞浆包涵体中，多数学者认为它参与了神经元的变性过程。α-synuclein神经元毒性机制复杂，涉及很多方面如蛋白构象改变或过度表达、蛋白聚集和错误折叠、线粒体功能障碍、内质网/高尔基体应、氧化应激等等，而且其事件主次和发生顺序仍不明确，具体的机制有待于进一步的研究证实。

携带A53T突变人α突触核蛋白转基因帕金森病大鼠模型。

背景品系为SD(Sprague Dawley, SD)大鼠，为大鼠（rat；rattus norregicus）的一个品系，属于动物界、脊索动物门、脊椎动物亚门、哺乳纲、啮齿目、鼠科、大家鼠属（Genus Rattus）、大家鼠种（Species rattus norvegicus）的动物，1925年，美国斯泼累格•多雷（Sprague Dawley）农场用Wistar大鼠培育而成。

将人类α–syn A53T突变基因插入到脑组织特异启动子PDGF的下游，构建α –syn A53T表达载体。用显微注射法将线性化的转基因载体注射到SD大鼠的受精卵中，用Wistar大鼠作假孕受体，制备转基因大鼠。转基因大鼠在出生7 d，用碱裂解法提取基因组DNA。PCR法鉴定转基因首建鼠及其子代基因型。Western blot检测转基因大鼠脑组织中人α –synuclein蛋白的表达。

1. 转基因表达α –syn A53T导致大鼠中脑TH阳性神经元数目减少

酪氨酸羟化酶(TH)是多巴胺（DA）能神经元合成的限速酶，通过检测TH阳性细胞数目及TH蛋白表达情况可反映多巴胺神经元功能状态。取1月龄和7月龄转基因大鼠及同窝阴性对照鼠中脑组织切片进行免疫荧光和免疫组化染色。结果发现，1月龄对照鼠中脑黑质TH阳性神经元形态正常、数目丰富，而转基因鼠TH阳性神经元数目和对照鼠相比没有显著变化； 7月龄转基因鼠TH阳性神经元数目和对照鼠相比显著减少（69%，P <0.05，图2），且形态异常。

2. 转基因表达α –syn A53T导致大鼠中脑神经元胞浆内α –synulcien 聚集

取7月龄转基因大鼠及同窝阴性对照鼠中脑黑质组织切片进行免疫荧光染色发现，和对照鼠相比，转基因鼠中脑黑质神经元出现α –synuclein 阳性着色，且和酪氨酸羟化酶(TH)阳性的神经元共定位，提示α –synuclein在多巴胺能神经元中特异表达（图3）。免疫组化显示，黑质致密部虽无典型的路易小体出现，但神经元胞浆内有大量的α –synuclein聚集，而且α –synuclein阳性黑质神经元形态异常，较对照组中脑黑质神经元体积小（图4）。

3. 转基因表达α –syn A53T导致大鼠动作协调能力下降

选取7月龄转基因大鼠和同窝阴性对照鼠分别进行Rotating rod实验，发现转基因大鼠较阴性对照大鼠在转棒仪上运动时间减短，动作协调能力下降。7月龄阴性对照雄鼠（n=6）在转棒仪上平均潜伏期为40.3 s，而转基因雄鼠(n=14)平均潜伏期为7.3 s，下降约40%。7月龄阴性对照雌鼠（n=5）在转棒仪上平均潜伏期为180 s，而转基因雌鼠（n=7）平均潜伏期为70s，下降约60%。进行t检验，7月龄转基因大鼠较阴性对照组统计结果均为P<0.05(图5)。

4. 转基因表达α –syn A53T导致大鼠步态障碍

7月龄转基因大鼠（n=8）和同窝阴性对照鼠（n=5）步态实验结果显示，与对照组比，转基因组前肢步宽、后肢步宽、左前摆时长、左后摆时长、右前摆时长、左后足迹最大面积和右前足迹最大面积等7项指标有显著性的变化（表1）。转基因大鼠的前肢步宽加大了47%（P<0.01），后肢步宽加大了34%（P<0.05），左前摆时长、左后摆时长和右前摆时长分别缩短了11%（P<0.05）、12%（P<0.05）和14%（P<0.01）。转基因大鼠的左后足迹最大面积和右前足迹最大面积分别减小了39%（P<0.05）和16%（P<0.01）。

本实验采用健康成年SPF级老鼠。饲料垫料均为高压灭菌产品，购自北京维通利华实验动物有限公司，动物用水均经过除菌处理。实验动物以完整的包装直接进入实验室，观察适应5天后无异常情况，方进行实验。实验过程中动物操作均符合动物伦理学规范，对环境和生态影响等符合国家相关法律规定。

给予动物鼠笼倾斜、潮湿垫料、高温、噪音、束缚、电击、游泳、昼夜节律颠倒等不同刺激因子，且刺激因子安排为多变性和不可预测，可诱导性是模型制造成功的关键。该模型被广泛用于抑郁症神经生物学机制及抗抑郁药物的研究，以及伴发的焦虑、学习记忆障碍及防护药物研究。

本研究中，通过水迷宫实验、避暗实验结果可以看CUMS模型组水迷宫寻台潜伏期显著性延长，避暗错误次数显著性增加、避暗潜伏期显著性减少等，这些行为学结果，提示大小鼠CUMS模型成功。此外本实验还对CUMS模型的机制进行了基础研究，认为CUMS模型会导致动物皮层的5-HT、DA、Ach、NE等神经递质水平显著性降低（P<0.05）。因此我们认为采用慢性不可预测应激，35天可以造成大鼠和小鼠学习记忆障碍。

模型技术难点在于对于CUMS刺激因子的选择，刺激因子的选择可能影响实验模型的成功与否，常用的刺激因子有禁食(12 h)、禁水(12 h)、冷水游泳(4 °C，5 min)、热水游泳(42 °C，5 min)、动物叫声(0.5 h)、束缚(使用自行研发的小鼠行为限制器，长20 cm，直径7 cm)、昼夜颠倒、配对饲养、湿笼、倾笼等。每日选择2~3 种刺激，并尽量使应激程序符合不可预测的特点，以避免动物产生适应性。相同的刺激因子应该隔3-7日再进行。

本研究通过不同的刺激因子对老鼠造成慢性不可预测应激模型，通过水迷宫、避暗等经典行为学指标，以及5-HT、DA、Ach、NE等神经递质基础机制指标，表明了慢性不可预测应激诱导老鼠学习记忆损伤模型的成功，并且该模型对于大小鼠具有相同的效果，本模型可用于进一步的改善学习记忆药物的药效学评价。